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Comment Extraire le DNA des
Fruits
G. Carboni, Septembre 2005
Traduit par Caroline Varin, Avril 2007
INTRODUCTION
Ces dernières années, il n’est pas rare de lire des articles sur le DNA dans
des magazines tant scientifiques que populaires. Le DNA est régulièrement cités
dans les informations et on y fait souvent référence dans les feuilletons
scientifiques à la télévision. Le DNA, aussi connu sous le nom d’Acide Désoxyribo
Nucléïque, est une longue molécule qui contient l’information génétique de tout
être vivant, qu’il soit végétal, animal ou simplement un microorganisme. Il est
capable de se recopier pour synthétiser de l’Acide Ribo Nucléïque (RNA). Dans
les formes de vie plus évoluées ou plus complexes, le DNA est contenu dans le
noyau des cellules. Excepté dans les globules rouges des mammifères, qui sont
dépourvus de noyau, toutes les cellules d’un être vivant contiennent de le DNA.
Les cellules de l’organisme n’utilisent q’une partie de la molécule de DNA –
partie appelée gène – pour produire les protéines dont elles ont besoin pour
fonctionner. Pour une description plus détaillée du DNA incluant sa structure,
sa fonction et les mécanismes de production des protéines les lecteurs pourront
consulter la liste de textes dans la partie bibliographie de ce document – ces
textes sont bien écrits et contiennent des illustrations intéressantes. Dans cet
article, je décris une expérience simple qui vous permettra d’extraire un peu
du DNA de banana, bien que vous puissiez l’utiliser également avec d’autres
fruits et même avec les légumes. C’est une expérience qui peut aussi bien se
faire à la maison qu’à l’école.
PROCEDURE
RESUME DE LA PROCEDURE
La procédure décrite ci après exploite le fait que la membrane externe des
cellules et de leur noyau sont composés de substances grasses qui peuvent être
brisées en utilisant un simple détergent. La première opération de cette
procédure est de broyer le fruit ou de le mixer de manière à ce que les cellules
soient le plus séparées possible les unes des autres de manière à les exposer au
détergent. Dans un deuxième temps, on ajoute le détergent à la pulpe du fruit de
manière à libérer le DNA de les membranes qui l’enferment. Dans un troisième
temps, il est nécessaire de filtrer la mixture pour séparer les acides
nucléiques du reste des cellules. Finalement, le DNA précipite dans l’alcool où
il devient visible. Le DNA obtenu par cette procédure peut être observe avec un
microscope et peut être utilisé pour d’autres expériences comme
l’électrophorèse.
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OPERATIONS PRELIMINAIRES
MATERIEL
- pot;
- thermomètre;
- saladier en plastique;
- Glaçons;
- 50mLc de 70 - 95 % isopropyl ou alcool dénaturé (éthanol) dans une bouteille
fermée;
- papier filtre ou tissu absorbant.
METHODE
- La veille de l’expérience, préparez quelques glaçons;
- au moins deux heures avant, placez dans le congélateur une bouteille étanche
contenant 50 mL de 70-95% isopropyl ou alcool dénaturé. Ce récipient doit être
fermé de manière étanche pour éviter que les vapeurs d’alcool ne s’échappent car
elles sont inflammables;
- 15 minutes avant de démarrer la procédure, chauffez un pot d’eau du robinet à
60°C.
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Figure 2 – Avant de commencer l’expérience il est
important de réaliser les étapes préliminaires décrites ici. |
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Figure 3 – Préparation de la solution extractante
(eau distillée, sel de cuisine, détergent, seringue,
bécher de 100 mL et une cuillère). |
PREPARATION DELLA SOLUTION D'EXTRACTION
Comme mentionné précédemment, le DNA est continu dans le noyau
des cellules des fruits sur lesquels nous allons travailler. Pour libérer le DNA,
il va être nécessaire de briser les membranes des cellules ainsi que celles des
noyaux. Comme ces membranes sont faites de phospholipides, qui sont des
molécules riches en acides gras, nous allons les dissoudre en utilisant un
simple détergent ménager. Nous utiliserons également un peu de sel de table, qui
aide à éliminer les protéines, appelées histones, dans lesquelles le DNA est
emballé.
MATERIEL:
- 100 mL d’eau distillée, mais de l’eau du robinet convient aussi;
- un système pour peser de faibles masses (si possible);
- 3 g de sel de table (une demi cuillère à café);
- 10 mL de détergent liquide;
- une seringue de 10 mL sans aiguille;
- un bécher de 100 mL;
- une baguette en verre.
METHODE
- Mettez 3 g de sel et 80 mL d’eau distillée dans le bécher de 100 mL;
- mélangez jusqu’à ce que le sel soit complètement dissout;
- avec la seringue, prenez 10 mL de détergent liquide et ajoutez le à la
solution;
- ajoutez de l’eau distillée jusqu’à obtenir un volume total de 100 mL ;
- en évitant de produire des bulles, mélangez pour homogénéiser la solution.
- la solution extractante est prête.
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PREPARATION DE LA PULPE
Cette opération cherche à séparer les cellules les unes des
autres pour permettre une meilleure action de la solution d’extraction.
MATERIELS
- 100 g de banane (ou: kiwi, poire, pomme, kaki, pois, oignon, etc.);
- balance;
- couteau;
- planche à découper et une fourchette;
- bécher de 250 mL;
- cuillère à thé.
METHODE
- Placez 100 g de banane (sans la peau) sur une planche à découper et écrasez la
avec une fourchette jusqu’à obtenir une purée. Si vous utilisez un oignon, avec
un couteau découpez des petits cubes de 5mm de coté au maximum. Vous pouvez
aussi utiliser un mixer. Si c’est le cas ne mixez pas la pulpe trop longtemps;
- placez le mélange dans un bécher de 250 mL.
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Figure 4 - Préparation de la pulpe de fruit. |
EXTRACTION DU DNA
Le but de cette opération est de rompre la membrane des cellules
et de leur noyau pour libérer le DNA. La pulpe doit être chauffée à 60°C pour
accélérer le processus de rupture des membranes. Chauffer la pulpe aide aussi à
désactiver certaines enzymes comme la DNase qui peut dégrader le DNA. Cependant,
si la pulpe est chauffée à une température trop élevée et pendant un trop long
moment le DNA commence à se fragmenter en raison de son exposition à la chaleur.
Pour cette raison, après 15 minutes il est judicieux de refroidir la pulpe dans
un bain d’eau réfrigéré pendant 5 minutes.
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Figure 5 – Placez la solution d’extraction dans la pulpe
et mixez le tout. |
Figure 6 – La pulpe doit être gardée à 60°C pendant un
temps de 15
minutes puis doit être réfrigérée dans un bain à 0°C pendant 5 minutes. |
MATERIEL
- Thermomètre;
- récipient avec de l’eau à 60°C;
- saladier avec de l’eau du robinet et des glaçons.
METHODE
- Placez la solution d’extraction dans la pulpe;
- mettez le bécher au bain marie dans le récipient contenant de l’eau à 60°C;
- mixez le mélange pour répartir la solution extractante et pour homogénéiser la
température du mélange;
- après 15 minutes, placez le bécher au bain-marie dans l’eau avec les glaçons;
- remuez le mélange pour rendre la température uniforme;
- après 5 minutes sortez le bécher de l’eau froide et préparez vous pour la
filtration.
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FILTRATION
Le procédé de filtration est utilisé pour recueillir le liquide
riche en AND et pour le séparer des résidus de cellules et des autres tissues
qui composent le fruit, qui sera laissé de côté.
MATERIEL
- Passoire avec un diamètre de 12 cm environ;
- papier filtre pour café (le papier filtre de laboratoire est trop épais). Le
papier essuie-tout de cuisine peut aussi être utilise, pourvu qu’il n’ait pas de
trou visible;
- bol.
METHODE
- Placez la passoire sur un bol;
- prenez un papier filtre, pliez le, mouillez le et placez le dans la passoire;
- placez un peu de pulpe sur le filtre, en prenant soin pour qu’il reste sur le
papier filtre;
- appuyez avec précaution pour aider à la filtration en évitant d’accrocher le
papier filtre;
- le liquide filtré que vous obtenez est riche en DNA.
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Figure 7 – Filtrez la pulpe en utilisant une
passoire, un papier filtre et un bol. |
ENLEVEMENT DES PROTEINES (optionnel)
Avec cette opération supplémentaire il est possible d’obtenir un
DNA plus pur, mais cela n’est pas essential à l’observation du DNA. Le DNA est
enroulé dans des protéines appelées histones. On peut enlever ces
protéines pour obtenir un DNA extrait d’une meilleure qualité. A ce but, vous
pouvez utiliser des enzymes protéolytiques comme les protéases. Vous pouvez vous
procurer des protéases dans des magasins qui vendent des produits chimiques,
vous pouvez aussi les remplacer par une substance beaucoup plus facile à
trouver. Il s'agit du jus d’ananas qui contient de la broméline, une substance
capable de casser les protéines en acides aminés dont elles sont composées et
donc d'en faciliter l'elimination.
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Figure 8 – Obtention du jus d’ananas. |
Figure 9 – dans un tube à essais placez
5 mL du filtrat et 1 mL de jus d’ananas. |
MATERIEL
- Enzyme Protéolytique (ex: Protéase ou jus d’ananas);
- une seringue de 5 mL sans aiguille.
METHODE
- Dans un tube à essais, placez 5 mL de la solution filtrée;
- ajoutez 1 mL de jus d’ananas et mélangez;
- attendez 2 - 3 minutes pour laisser à la broméline le temps d’agir.
PRECIPITATION DU DNA
Le DNA est assez soluble dans l’eau où il est invisible, alors
qu’il est très peu soluble dans l’alcool dans lequel il précipite et devient
visible. En ajoutant de l’alcool à la solution de DNA dans le tube à essais,
le DNA devient visible.
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Figure 10 – Tout doucement ajoutez de l’alcool refroidi
dans le tube et évitez de mélanger l’alcool au filtrat. |
Figure 11 - Tube contenant le DNA de banane avec de nombreuses
petites bulles d’air libérées par le réchauffement de l’alcool. Dans la
Figure 1, il y a moins de bulles et le DNA est observé comme une
substance laiteuse.
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MATERIEL
- Quelques tubes pour l’éventuelle répétition de la manipulation;
- support pour tubes à essais;
- de l’alcool refroidi (gardé au réfrigérateur).
METHODE
- Doucement ajoutez dans le tube à essais de l’étape précédente, un peu
d’alcool refroidi en évitant de remuer le filtrat;
- le volume d’alcool ajouté doit être à peu près le même que celui du filtrat;
- laissez reposer le tube pendant 5 minutes pour permettre au DNA de précipiter
et de se regrouper dans le tube.
Maintenant, à l’interface entre l’alcool et le filtrat vous
devrez voir une substance laiteuse, dont le volume tend à augmenter au cours du
temps. Cette substance laiteuse est le DNA de banane. Malheureusement, dans cette
petite masse laiteuse, vous il y a de nombreuses petites bulles. La présence de
ces bulles est due au fait que la solubilité des gaz dans un liquide, augmente
lorsque la température de ce liquide diminue. Quand l’alcool était dans le
réfrigérateur, il a absorbé des gaz qui sont expulses quand l’alcool se
réchauffe.
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OBSERVATION AU MICROSCOPE (optionnel)
MATERIEL
- Des lames de microscope propres;
- un crochet fait avec une longue tige de métal;
- un colorant pour marquer les noyaux (ex: bleu de méthylène, Toluidine);
- compte goutte;
- microscope.
METHODE
- avec une longue tige de métal qui se termine par un crochet, extrayez un
échantillon de DNA du tube et placez le sur une lame de microscope propre;
- répartissez la masse sur la lame et teignez là avec un colorant nucléaire;
- si nécessaire, ajoutez un peu d’eau et placez une lamelle par dessus.
En observant cette préparation sous un microscope, n’espérez pas observer
la très célèbre structure en double hélice imbriquée du DNA. Vous ne
pouvez pas la voir, même au microscope électronique. Ce que vous verrez sont
des amas ou flocs de matériel DNA qui ressemble à un enchevêtrement de brins
de protéines comme le montre la Figure 12.
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Figure 12 – Echantillon de DNA de banana à un
grossissement de 100 (teintée avec une solution
de Toluidine à 1%). |
CONCLUSION
Cette expérience n’était pas si difficile que ça à réaliser
après tout, n’est ce pas? Le but de cette simple expérience était de vous
initier aux procédures utilisées en biologie moléculaire. Souvent les techniques
utilisées en laboratoire de microbiologie moderne repose sur des opérations
simples comme celle-ci. Dans d’autres cas la procédure peut être assez complexe
et peut nécessiter des manipulations et des équipements beaucoup plus
sophistiqués. Dans tous les cas de grandes connaissances en biologie et en
chimie sont nécessaires pour comprendre comment le DNA est utilisé dans les
domaines de la biologie et de la médecine. Si cette expérience a suscité un
intérêt dans la poursuite de vos explorations futures, souvenez vous que les
ressources disponibles sur Internet peuvent vous conduire à de nouveaux sujets
de curiosité. Si vous voulez en apprendre plus, référez vous au document [2]
dans la section bibliographie de cet article. L’extraction du DNA est la
première étape de beaucoup d’autres expériences fascinantes.
BIBLIOGRAPHIE
1 - Helena Curtis, N. Sue Barnes; "Biology"; Worth
Publishers, Inc., New York; un texte de biologie pour grandes écoles.
2 -
http://www.funsci.com/texts/wsites_en.htm Cherchez le mot: "SAPS". Vous
trouverez des instructions pour faire d’autres expériences amusantes et
intéressantes.
Mots clés pour Internet: DNA extraction, protéine de DNA, acides
aminé, ribosomes..
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